急性髓系白血病 ( acute myeloid leukemia, AML ) 是成年人常见的血液系统恶性肿瘤之一，主要表现为髓系原始细胞克隆性恶性增殖及正常造血细胞功能抑制。在AML基因突变图谱中，fms样酪氨酸激酶3 ( fms-like receptor tyrosine kinase 3, FLT3 ) 基因突变最为常见，存在于约1/3初诊AML患者。FLT3突变形式主要包括跨膜区内部的串联重复突变 ( ITD ) 和累及活化环中的点突变( TKD ) 两种形式。虽然这些突变影响细胞功能的分子机制尚不清楚，但大量临床研究已表明，携带FLT3突变的AML患者预后不良，这也催生了一系列FLT3抑制剂 (FLT3i) 的研发及临床运用。

FLT3i尽管可以有效地清除外周循环血中的白血病细胞，但部分AML细胞仍可存在于骨髓微环境中，这种现象被称为早期抵抗 (early resistance)，这些残存的细胞在受到分子刺激后还会引起AML持续发展。遗憾的是，出现早期抵抗的细胞数量极少，只有当这些细胞不断增殖导致肿瘤复发，也被称为晚期抵抗 (late resistance) 时，才能着手加以研究，很大程度上限制了对于AML细胞整个治疗抵抗发展过程及相关分子特征的认识。 Gilteritinib是一种强效FLT3i，FDA批准其用于治疗患有复发或难治性AML成人患者。近日，来自俄勒冈健康与科学大学的Elie Traer教授团队，利用蛋白基因组学 (proteogenomics) 研究策略系统分析了gilteritinib治疗引起的AML治疗抵抗全过程中细胞基因组、蛋白质组、磷酸化修饰组等方面分子功能的变化。相关结果以“_The AML microenvironment catalyzes a stepwise evolution to gilteritinib resistance" 为题 [1] ，发表于Cancer Cell。_

01肿瘤微环境引起的AML细胞治疗抵抗

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研究人员利用纤维母细胞生长因子FGF2或FLT3配体FL分别与gilteritinib共同刺激MOLM14细胞 (人AML FLT3-ITD+细胞系) 约4个月的时间 ，以模拟AML患者接受gilteritinib治疗时，骨髓微环境对AML细胞的保护作用。FGF2和FL分别通过激活MAPK/PI3K/AKT信号、恢复FLT3活性，有效地启动AML细胞早期治疗抵抗效应，逆转glitertinib对细胞的杀伤作用。4个月后去除FGF2和FL，gilteritinib仍可短暂抑制AML细胞生长，但随后，细胞MAPK/PI3K/AKT信号再次激活导致晚期治疗抵抗现象，这一现象由于不再依赖任何FGF2或FL，因此也被称作配体非依赖的晚期治疗抵抗 (ligand-independent late resistant)。_

图1 FGF2和FL对AML细胞gilteritinib治疗敏感性的影响

02NRAS突变与AML细胞晚期抵抗相关性

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全外显子测序 (WES) 结果显示，晚期治疗抵抗MOLM14细胞以及基因编辑产生的gilteritinib耐药细胞系MV4;11都出现了多种NRAS点突变。构建的MOLM14_NRAS_G12S/D突变细胞则在初期对gilteritinib治疗十分敏感，提示NARS突变不足以立即引起细胞耐药，但却可以引起配体非依赖的晚期治疗抵抗；另一方面，FGF2或FL也能提前治疗抵抗发生时间，强调了肿瘤微环境对细胞治疗效果影响的重要性。_

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图2 _NARS突变对AML细胞glitertinib治疗敏感性的影响_

03AML细胞治疗抵抗过程中蛋白质功能改变

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随后，结合蛋白质组学、磷酸化修饰组学技术，研究人员在MOLM14亲代细胞和早期、晚期gilteritinib治疗抵抗细胞中一共鉴定到了7694个蛋白质和36004个磷酸化肽段。主成分分析 (PCA) 显示，不同类型细胞的 (磷酸化) 蛋白质特征明显彼此区分；激酶-底物富集分析 (KSEA) 表明，在AML细胞出现早期治疗抵抗时，与细胞周期发展相关的激酶 (CDK1, 2, 4, 5, 6, 7, 9) 活性明显降低，而细胞周期检查点 (PRKCA, CSNK2A1)、DNA损伤反应调控相关激酶活性则升高；上述现象在晚期治疗抵抗中明显反转，表现为CDK家族激酶活性升高。从CausalPath信号通路分析也可以看出，早期抵抗时AML细胞周期信号通路活性明显降低，而在后期，CDKs和MAPK相关信号通路活性则显著增强。_

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图3 AML细胞早期/晚期治疗抵抗过程中蛋白质及磷酸化修饰水平的改变

04细胞周期调控AML早期治疗抵抗
FGF2和FL刺激导致早期耐药的MOLM14细胞与亲代细胞相比，进入S期的细胞数量明显减少，而G2/M期细胞数量却未发生明显改变，提示细胞周期停滞；晚期出现治疗抵抗的细胞周期状态则与未处理的亲代MOLM14细胞类似。细胞周期激酶Aurora 参与细胞有丝分裂过程中染色体的调节、胞质分裂和动粒-微管连接等。研究人员发现Aurora激酶B (AURKB) 抑制剂 (AZD2811) 以及CRISPR/Cas9敲除AURKB都增强了AML细胞早期对gilteritinb的敏感性，证明了AURKB调控AML早期细胞耐药。

图4 细胞周期对AML治疗抵抗的影响

05AML细胞治疗抵抗过程中蛋白质功能改变

最后，研究人员利用靶向蛋白质组学技术分析了11例临床AML患者，在经gilteritinib治疗前后，白血病细胞 (CD33+ CD34+) 中123个蛋白质含量变化的情况。其中，52个蛋白质含量在gilteritinib治疗后出现了明显改变，这些蛋白质主要为：（1）调控细胞周期进程的蛋白质含量明显减少，包括CDK1/2/4/9；（2）MAPK信号通路和脂肪酸代谢通路蛋白质增加。考虑到此前研究结果已证明AURKB在AML细胞系早期治疗抵抗中的重要作用，研究人员也进一步研究了AURKB抑制剂AZD2811对AML患者白血病细胞的影响，结果显示，AZD2811对治疗前的AML细胞gilteritinib敏感性影响不大，但是明显地提高了gilteritinib杀伤早期抵抗细胞的效果。更为重要的是，通过调研BeatAML数据库397例AML患者治疗数据，研究人员也发现FIT3-ITD突变AML患者对AZD2811治疗更敏感，但进展到晚期出现NARS突变的患者则对AZD2811不敏感，侧面反映了抑制细胞周期调控激酶AURKB活性对扼制AML早期抗药性的重要性。

总的来说，此项研究证实了AML细胞在经gilteritinib治疗后出现早/晚不同阶段治疗抵抗，在此基础上，利用基因组、蛋白质组、磷酸化修饰组学等技术详细研究了两个阶段细胞的分子特征，发现晚期NRAS突变，早期细胞周期相关激酶抑制等标志性事件，并结合AML患者细胞实验及大规模临床数据揭示了AURKB调控AML早期治疗抵抗的关键作用。这些结果也为实现AML的彻底根除奠定了重要基础。

参考文献：

Sunil K. Joshi, et al. 2021. The AML microenvironment catalyzes a stepwise evolution to gilteritinib resistance. Cancer Cell.